青霉素的发现与发展

全球化学史的里程碑

1999年11月19日,英国伦敦的亚历山大·弗莱明实验室博物馆认定青霉素的发现和发展为全球化学史的里程碑。同时,也表彰了位于伊利诺伊州皮奥里亚的美国农业部国家农业利用研究中心以及在二战期间为青霉素的生产研究做出卓越贡献的五家公司。这五家公司包括:雅培、Lederle Laboratories(现为辉瑞公司)、默克公司、Chas. Pfizer & Co. Inc.(现为辉瑞公司)和 E.R. Squibb & Sons(现为百时美施贵宝公司)。

20世纪40年代,青霉素始用于临床,开启了抗生素时代,被公认是治疗医学领域最伟大的进步之一。虽然英国首先发现青霉素并初步认识到其治疗潜力,但受二战影响,美国却是推动青霉素大规模生产的首功之臣,使这种可拯救生命的稀缺药物随处可得。

目录

亚历山大·弗莱明发现青霉素

青霉素揭开了抗生素时代的序幕。在青霉素问世之前,人们对肺炎、淋病或风湿热等传染病束手无策。医院里到处都是因割伤或抓伤而感染败血症的患者,医生们却无计可施,只能静静地等待并为患者祈祷。

抗生素是由细菌和真菌产生的化合物,能够杀死或抑制与之有竞争关系的微生物物种。 其实人类早就注意到这一现象,所以古埃及人才会在被感染的伤口上敷发霉的面包。但直到1928年,伦敦圣玛丽医院的细菌学教授亚历山大·弗莱明发现青霉素后,人类才首次真正发现抗生素。

1928年9月3日,度假归来的弗莱明开始整理含有葡萄球菌菌落的培养皿。葡萄球菌是一种会引起疖子、咽喉痛和脓肿的细菌。他突然注意到一个培养皿有些异常。这个培养皿上散布着很多葡萄球菌菌落,但有一个地方生长着一团霉菌。霉菌周围并无菌落,它似乎分泌了一些东西来抑制细菌生长,后来确定这种霉菌为一种稀有菌株,即特异青霉素。

弗莱明发现,它的“霉菌液”能够杀死多种有害细菌,如链球菌、脑膜炎球菌和白喉杆菌。于是,弗莱明给他的助手斯图尔特·克拉多克和弗雷德里克·雷德利布置了一项艰巨的任务-从霉菌液中分离出纯青霉素。霉菌液极不稳定,因此他们只能制备一些原料溶液来使用。1929年6月弗莱明在《英国实验病理学期刊》上发表了此发现,并简略谈及了青霉素的潜在治疗效果。在这个阶段,青霉素的真正价值并未真正显现,主要应用在混合培养中把对青霉素不敏感的细菌和对其敏感的细菌分离开来。但这至少给细菌学家带来了一些切实好处,并让大家继续保持对青霉素的兴趣。其他学者也曾试图提纯青霉素,包括伦敦卫生与热带医学学院的生物化学教授哈罗德·雷斯特里克,但都没有成功。

牛津大学的青霉素研究

霍华德·弗洛里、恩斯特·查恩及其在牛津大学威廉·邓恩爵士病理学院的同事将青霉素从实验室中的一种新奇物质变成了能够拯救生命的药物。1939年他们正式开始青霉素的提纯和化学研究工作。纷飞的战火让研究工作难如登天。为了开展一项动物实验和临床试验,该团队每周需要处理多达500升的霉菌滤液。团队开始在一些不同寻常的培养容器中接种霉菌,比如浴盆、便盆、牛奶罐和食品罐。后来,他们为这项计划量身设计了一个发酵容器,不但便于拆除,节省空间,也方便研究人员更换霉菌下面的肉汤。他们还以每周2英镑的薪资雇用了一些女孩,让她们负责接种和一般的发酵工作。实际上,牛津大学的实验室逐渐变成了一个青霉素工厂。

同时,生物化学家诺曼·希特利使用逆流系统从生产线产生的大量滤液中提取出了青霉素,方法是将青霉素提取到乙酸戊酯中,然后再将其溶解到水中。随后,受雇帮助提高青霉素产量的另一位生物化学家爱德华·亚伯拉罕使用新发现的氧化铝柱色谱技术在临床试验前成功地去除了青霉素中的杂质。

1940年,弗洛里进行了一项重要实验,证实青霉素可以帮助小鼠抵抗致命链球菌的感染。后来,在1941年2月12日,一位43岁的警察阿尔伯特·亚历山大成为第一个注射牛津大学青霉素的人。他在修剪玫瑰时划伤嘴角,发生致命了感染,巨大的脓肿侵袭了他的眼睛、脸部和肺部,对他的生命造成了严重威胁。医生为他注射了青霉素,几天后他的病情就得到了显著改善。但因为药物很快就用光了,他在几天后不幸离世。幸运的是,青霉素在其他患者身上表现出很好的疗效。很快,人们就计划让战场上的英国军队使用青霉素。

要在战乱时节生产青霉素并非易事,但一些英国公司选择迎难而上,包括葛兰素(现为葛兰素史克)和后来被辉瑞公司收购的伦敦 Kemball Bishop 公司。

二战期间青霉素在美国的生产

要证明青霉素在早期临床结果显示出的潜力,必须用大量青霉素来进行广泛的临床试验。如果青霉素确实能发挥作用,也需要充足的供应量以用于治疗。弗洛里认识到,在英国大规模生产青霉素如同水中望月,因为英国的化学工业正在“全心全意”地为战争服务。在洛克菲勒基金会的支持下,1941 年夏天,弗洛里及其同事诺曼·希特利前往美国,尝试能否使美国制药业对大规模生产青霉素感兴趣。

耶鲁大学的生理学家约翰·富尔顿,向他们引荐了多位可能助其一臂之力的人士。这其中就包括农业部的罗伯特·托姆。他是一位非常重要的霉菌学家,也是青霉菌领域的权威人士。最终,他们与农业部位于伊利诺伊州皮奥里亚的北方地区研究实验室 (NRRL) 建立了联系,该实验室的发酵部门拥有高水平的专业技术。事实证明,此举对计划的成功至关重要,正是由于NRRL在创新方面的突出贡献,青霉素大规模生产才得以实现。

提高青霉素的产量

经NRRL主任奥维尔·梅同意,发酵部主任罗伯特·科吉尔带领实验室开展了用以提高青霉素产量的工作。大家同意让希特利留在皮奥里亚,以便与美国同事分享专业知识。几周后,安德鲁·莫耶发现,通过用乳糖代替牛津大学团队在培养基中使用的蔗糖,可以大幅提高青霉素的产量。此后不久,莫耶便有了更重要的发现,即在发酵介质中加入玉米蒸馏液会将产量提高10倍。玉米浆是玉米湿磨加工的副产品,在一次寻找玉米浆用途的实验中,NRRL 将玉米浆应用于所有发酵试验中。随后,皮奥里亚实验室又将青霉素前体(如苯乙酸)加入发酵介质,进一步提高了青霉素的产量。

人们认识到,牛津大学小组在培养基表面培养霉菌的方法效率较低,深层培养效果更好。 在深层培养发酵中,霉菌生长在大罐里的混合物中,研究人员不断搅拌混合物,为其充气,这样霉菌就不仅仅只在培养基的表面生长。然而,在弗洛里的青霉菌培养尝试中,深层培养只产生了微量的青霉素。在肯尼斯·拉普的指导下,NRRL 的工作人员筛选了各种青霉菌菌株,找到一种能在深层培养中达到合格产量的青霉素。

很快,NRRL开始在全球寻找更好的青霉素生产菌株,来自世界各地的土壤样本先后收集到NRRL。 出乎意料的是,产量最高的菌株竟然来自皮奥里亚水果市场的一个发霉的哈密瓜。在卡内基研究所,研究人员用 X 射线培育出了更高产的哈密瓜菌株突变体。之后,研究人员在威斯康星大学将这种菌株暴露在紫外线辐射下,使其生产力得到进一步提高。

美国制药公司支持生产

当诺曼·希特利留在皮奥里亚帮助NRRL工作人员启动青霉素研究工作时,霍华德·弗洛里则拜访各家制药公司,努力让它们对这种药物产生兴趣。尽管此行的直接结果让弗洛里感到失望,但其实其中三家公司(默克公司、施贵宝公司和礼来公司)在弗洛里到来之前就进行了一些青霉素研究,而辉瑞公司似乎也即将启动对这种药物的研究。但此时,青霉素的前景仍然只依托于有限的临床试验。

接下来,弗洛里拜访了他的老朋友,时任宾夕法尼亚大学医疗事务副校长的阿尔弗雷德·牛顿·理查兹。更重要的是,理查兹是科学研究和发展办公室 (OSRD) 医学研究委员会 (CMR) 的主席。OSRD成立于1941年6月,旨在确保公众对与国防有关的科学和医学问题研究给予充分关注。理查兹十分尊重弗洛里,并相信他对青霉素潜在价值的判断。 他联系了弗洛里提到的对青霉素有一定兴趣的四家药厂(默克、施贵宝、礼来和辉瑞),并告诉他们生产青霉素有利于维护国家利益,而且可能会得到联邦政府的支持。

1941年10月8日,理查兹在华盛顿特区召开了一场会议,会议就公司和政府进行的研究互通有无,并计划开展合作研究项目以加快青霉素的生产。除 CMR、美国国家科学研究委员会和美国农业部的代表之外,与会者还包括默克公司的伦道夫·T·马杰、施贵宝医学研究所的乔治·A·哈罗德、辉瑞公司的贾斯帕·凯恩以及 Lederle 的 Y·苏巴罗等研究主管。第二场 CMR 青霉素会议于 12 月在纽约举行,就发生在珍珠港事件和美国加入第二次世界大战后十天,这次会议更加具有决定性意义。 默克公司、施贵宝公司、辉瑞公司和 Lederle的负责人以及各公司的研究主管出席了此次会议。罗伯特·科吉尔报告称 NRRL利用玉米浆增产取得了成功,这令在场的业界领导人备受鼓舞。

科吉尔后来回忆到,基于当时的发酵技术和产量等限制因素,乔治·W·默克曾对生产足量的青霉素感到悲观无望,但在聆听了科吉尔的报告后,他立即表示如果这些结果能在实验室得到证实,就有可能为弗洛里生产一公斤的材料,整个业界都会行动起来! 经协商,大家同意各家公司将独立开展研究活动,但需要向CMR通报进展,如果委员会认为符合公众利益,可以将消息公之于众(经有关公司许可)。

虽然也会有人担心,如果能合成出可商业化的青霉素,在发酵工艺的投资就有可能会浪费,但这并未影响其他公司对青霉素的热情。一些公司自行制定了合作协议(例如,1942年2月默克公司和施贵宝公司制定了协议,9月辉瑞公司加入)。默克公司的试验工厂使用烧瓶和托盘,每周可不间断生产几百升青霉素培养液。12 月,希特利加入了默克公司研究小组并工作了数月。他首次将牛津杯碟法用于青霉素的测定,此方法迅速成为了行业标准方法。在OSRD的支持下,1942 年 3 月,默克公司生产出足量的青霉素并首次将其用于治疗,接受治疗的是康涅狄格州纽黑文市的安·米勒夫人。截止1942年6月又成功治疗了10个病例,所有青霉素均由默克公司提供。

青霉素生产规模扩大

将深层发酵从试验工厂扩大到生产规模存在很多固有问题,制药和化工公司在解决这些问题方面发挥了不可或缺的作用。随着生产规模的扩大,默克、辉瑞、施贵宝和其他公司的科学家们遇到了工程方面的新挑战。辉瑞公司的约翰·L·史密斯发现这些公司在扩大规模过程中面临着复杂性和不确定性: “霉菌就像歌剧演员一样反复无常,它产量低、分离难、提取难、纯化难,检测方法也不尽如人意。”

由于青霉素的生长需要空气,如何给深罐中的发酵混合物通气就成了一个难题。如果将玉米浆作为培养基,混合物中冒出的无菌空气会引起大量泡沫。施贵宝通过将单蓖麻油酸甘油酯作为消泡剂解决了这个问题。液体发酵还要求为大罐设计新的冷却系统并采用新的混合技术,以有效搅拌青霉素醪液。

礼来公司成功实现了通过喂养不同结构的前体使霉菌合成新类型的青霉素。由于青霉素的不稳定性和热敏性,多达三分之二的青霉素可能在纯化过程中丢失,这使得发酵后的回收工作十分艰难。提取是在低温下进行的。最终,研究人员利用在真空条件下冷冻干燥的方法获得了最佳结果,成功地纯化出稳定、无菌且可用的青霉素。

在从事青霉素试生产的化学家和工程师们的共同努力下,发酵、回收、纯化和包装的步骤迅速取得成效。1944年3 月1日,辉瑞公司在纽约布鲁克林开设了第一家通过深层培养大规模生产青霉素的工厂。

与此同时,军事和民用部门的临床研究也有力地证实了青霉素在治疗领域有广阔前景。 该药物被证明能够有效治疗各种感染,包括链球菌、葡萄球菌和淋球菌感染。美国军队建立了青霉素在治疗外科手术和伤口感染方面的价值。临床研究也证明了青霉素治疗梅毒的有效性。1944年,青霉素成为了英国和美国军队治疗梅毒的主要方法。

青霉素、二战和商业生产

青霉素对于战争的价值愈发显而易见,战争生产委员会 (WPB) 在1943年担负起增加青霉素产量的重任。WPB 细致考察了175家公司,然后选拔出了21 家公司参与由阿尔伯特·埃尔德指导的青霉素计划。除 Lederle、默克、辉瑞和施贵宝之外,雅培(在1943年中期之前是临床用青霉素的主要生产商之一)也是首批开展大规模生产青霉素的公司之一。 为达到生产目标,政府优先为这些公司提供建筑材料和其他物资。WPB负责分配所有生产出的青霉素。

其中一个主要目标是为拟议的诺曼底登陆准备充足的药物。战争时期的爱国主义情怀极大鼓舞了英国和美国的青霉素生产。例如,1943年,阿尔伯特·埃尔德在给制造商的信中写道:“请务必向工厂中的每个工人强调,你们今天生产的青霉素将在几天后拯救同伴的生命,或治疗伤残人士的疾病。在工厂里贴上标语!在工薪袋中放入通知!充分调动整个工厂的工作积极性,让最基层的工人也饱含热忱。”

有关这种新型“特效药”的宣传逐渐深入人心,导致对青霉素的需求日益增加。但起初的供应量十分有限,政府会优先考虑军事用途。

美国国家研究协会化学疗法委员会主席切斯特·基弗(来自波士顿)承担起民用药物配给的艰巨任务。基弗只得采取一项限制措施:只有在其他疗法均不奏效的情况下才能使用青霉素。他还负责收集有关青霉素使用的详细临床资料,以便形成关于其潜力和局限性充分认识。不出所料,很多人开始向基弗索要青霉素,让他应接不暇。1943年10 月17 日《纽约先驱论坛报》的一篇报纸报道称: “许多普通人,包括丈夫、妻子、父母、兄弟、姐妹、朋友,都向基弗博士索要青霉素。 面对每一个请求,基弗都告诉他们要出具由主管医生提供的关于患者病情的完整档案。收到档案后,他们会根据医疗情况做出决定,而不是被情感左右。”

幸运的是,1944年初青霉素的产量开始大幅增加。在美国,青霉素产量从 1943年的 210 亿单位跃升到1944年的1.663万亿单位,到1945年则超过了6.8万亿单位。生产技术也在规模和先进程度方面取得了长足的进步,从使用产量不足1% 的一升烧瓶发展为使用产量高达80-90%的一万加仑罐。最终,美国政府取消了对青霉素供应的所有限制。从1945 年3月15日起,青霉素通过常规渠道配销,消费者可以方便地在街角的药店购买。

到1949年,美国的青霉素年产量达到了1332.29亿单位,价格从1943年的每10万单位 20美元降至不到10美分。战争结束后,大多数英国公司转用由美国首创的深罐发酵法生产青霉素,以满足民用需求。1946年6月1日英国首次将青霉素作为处方药向普通民众出售。

在牛津大学多萝西·霍奇金 X射线晶体学研究的帮助下,英国的查恩和亚伯拉罕继续研究青霉素分子的结构。他们于1945年确定了青霉素独特的结构,即与噻唑烷环相融合的极不稳定的四元β-内酰胺环。同年,亚历山大·弗莱明、霍华德·弗洛里和恩斯特·查恩凭借青霉素研究荣获诺贝尔奖。

面对霍华德·弗洛里和诺曼·希特利在1941年提出的挑战,美国化学家、化学工程师、微生物学家、真菌学家、政府机构以及化学和制药企业通力合作,攻克了这一难题。 正如弗洛里在1949年所说:“对于美国制药公司面对青霉素大规模生产所表现出的进取心和干劲,我们致以崇高的敬意。没有他们付出的辛勤汗水,我们就无法在诺曼底登陆日之前生产出足够的青霉素来治疗重伤员,包括美国人和英国人。”

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里程碑认定及致谢

里程碑认定

美国化学学会和英国皇家化学学会于1999年11月19日在英国伦敦的亚历山大·弗莱明实验室博物馆将青霉素的发现和发展定为全球化学史里程碑。纪念该事件的匾额上写道:

1928 年,亚历山大·弗莱明在伦敦的圣玛丽医院发现了青霉素。此后抗生素得到应用,显著减少了因感染而死亡的患者人数。1941年,牛津大学的霍华德·W·弗洛里与恩斯特·B·查恩、诺曼·G·希特利、爱德华·P·亚伯拉罕通力合作,成功地将青霉素用于临床治疗。1939-1945年世界大战期间,在美国农业部北方地区研究实验室的科学家和工程师以及雅培、Lederle Laboratories、默克公司、Chas. Pfizer & Co. Inc. 以及 E.R. Squibb & Sons 的主导下,青霉素在美国得到了大规模发展。青霉素的发现和发展堪称二十世纪药物化学领域的里程碑。

特此颁发纪念匾额,以纪念美国农业部国家农业利用研究中心以及五家美国制药公司所做出的卓越贡献,这些公司包括雅培、Lederle Laboratories(现为辉瑞公司)、默克公司和 Chas . Pfizer & Co. Inc.(现为辉瑞公司)和 E.R. Squibb & Sons(现为百时美施贵宝公司)。

致谢:

改编自1999年美国化学学会和英国皇家化学会编制的《1928-1945年青霉素的发现和发展》一文,取自网络。

引用此页

美国化学学会全球化学史里程碑。青霉素的发现和发展。http://www.acs.org/content/acs/en/education/whatischemistry/landmarks/flemingpenicillin.html(访问时间为年月日)。

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阿拉伯语 (Arabic)

《1928-1945 年青霉素的发现和发展》纪念册,由美国化学学会美国化学史里程碑计划于 1999 年编制 (PDF)。
《1928-1945 年青霉素的发现和发展》纪念册,由美国化学学会美国化学史里程碑计划于 1999 年编制 (PDF)。

深罐发酵

根据二十年前首次运用发酵技术生产柠檬酸的经验,辉瑞公司成功地利用深罐发酵法生产了大量青霉素,进而实现了在战争结束前向盟军士兵提供青霉素。

深入了解深罐发酵的发展美国化学史里程碑(英文)。